« Fences » - un essai de migration cellulaire pour des plaques de culture cellulaires avec 24 multipuits

Introduction
Le système d′essai suivant a été conçu pour des plaques de culture cellulaires de 24 multipuits d′un diamètre de 16 mm. Les supports siliconés (« fences ») en acier et réutilisables définissent une aire standard où les cellules ont la possibilité d′adhérer et ainsi de se répandre (E.G.Fischer et al., 1990, J.Immunol.Meth. 128: 235-239). Cet essai consiste à étudier l′expansion des cellules monocouches telles que les cellules endothéliales ou musculaires (non concernées : les cellules immunitaires ou granulocytes).
Cet essai permet en outre une recherche en série, qui sous état stérile, côute peu de temps et de matériels. Ce système est utilisé dans différents instituts de recherche et entreprises pharmaceutiques mondiales et facilite l′étude de la migration des cellules monocouches sous l′influence de médicaments.
Cette recherche s′applique principalement aux cellules HUVEC ("Human Umbilical Vein Endothelial Cells") et aux cellules du muscle lisse humain (SMC : "smooth muscle cells") . Pour l′essai peuvent être employés des plaques multipuits de différents fabricants. Nous avons testé les plaques multipuits suivantes.

Avantages
L′essai reprend les idées de Pratt et al. (1984, Am.J.Path. 117: 349-354) et d′Hasson et al. (1986, Surgery 100: 384-391) qui, au départ, avaient utilisé pour cette recherche de gros anneaux. Mais des problèmes surgirent non seulement lors du retrait des anneaux des boîtes de Pétri mais aussi à cause du non respect des conditions de stérilité. Une utilisation intensive ne fut pas non plus possible en raison d′une nécessité de place limitée. Ces inconvénients furent surmontés grâce à l′apport de plaques multipuits avec de nouveaux supports, plus petits et plus efficaces. De même furent contournés les problèmes relatifs à la technique "wounded layer" de Stenn (1980, In Vitro 16; 357-360) ainsi que ceux inhérents aux techniques "under-agarose assay" ou système de chambre Bøyden.

Méthodique
Les fences doivent impérativement avant et après chaque utilisation être nettoyés et stérilisés. Afin de mieux préserver le silicone, il est conseillé de retourner les fences lors de la stérilisation et de son non-utilisation. Un détergent, de l′éthanol ou même un bain ultra-son de courte durée peuvent être utilisés pour le nettoyage.

La stérilisation s′effectue de préférence à 121°C (2 atm, humide). Une stérilisation à 180°C (1 atm, sec) est certes possible, mais une dégradation du silicone peut survenir à la longue. Vous remarquerez qu′après chaque stérilisation le silicone colle, c′est pourquoi, il est conseillé d′attendre une bonne heure avant de manipuler les fences.

Les fences rempliront une plaque de 24 multipuits, qui ira à peu près 30 minutes dans un incubateur préchauffé (à 37°C), afin que la tenue du silicone à la surface de chaque fence soit rendue possible.

Sous le régime d′expansion de la monocouche : Dans la chambre interne de chaque fence de 16 mm seront versées les cellules dans 150 µl de médium (correspondant par exemple à 30.000 HUVEC), et dans la chambre externe sera versé uniquement 650 µl de médium (sans les cellules) pour accroître l′étanchéité de la chambre interne.

Sous le régime "wound closure" (cicatrisation des plaies) se produit le cas inverse au cas précédent, c′est-à-dire que les cellules seront injectées dans la chambre externe dans 650 µl de médium (équivalent à par exemple 130.000 HUVEC) et dans la chambre interne y seront mis uniquement (sans les cellules) 150 µl de médium. Ainsi, on peut s′imaginer le développement d′un essai d′interactions cellulaires avec différentes cellules à l′intérieur et à l′extérieur. Il est important de pénétrer le plus profondément possible dans le fence avec la pipette, afin que toute création de bulle d′air soit évitée.

Après que les cellules aient eu le temps de se fixer dans l′incubateur pendant 4 à 5 heures, les fences seront retirées à l′aide d′une pince et chaque puit sera lavé deux fois prudemment (avec par exemple du Phosphate Buffered Saline), pour éloigner les cellules non-adhérentes. Ensuite sera incorporé avec ou sans les substances recherchées 1 ml médium. Il est recommandé d′effectuer cet essai 3 à 4 fois afin d′optimiser les résultats. Dès lors commence réellement l′essai.

Pour mieux faire la distinction entre migration et prolifération, soit on expose les cellules aux rayons à 15-25 Gy (1500-2500 rad) soit on ajoute à la procédure des essais une toxine (par exemple 10-20 µl/ml 5-Fluorouracil, selon certains articles jusqu′à 100 µl/ml) pour éviter la prolifération.

Le diamètre de la monocouche est au début de l′essai de 6,57 mm (varie selon le comportement cellulaire), ce qui correspond à une surface de 35 mm². Après une incubation d′environ 5 à 7 jours (avec HUVEC) avec des changements fréquents de médium (par ex. tous les 2 jours) s′est étendue la monocouche. Après ce délai, un mélange d′éthanol-méthanol (1 pour 1) ou 5 à 10% de la solution Paraformaldehyde-in-Buffer (pendant 3 à 10 minutes) sera introduit, ce qui permettra aux cellules de se fixer. Après un lavage, les cellules seront teintées (par ex. avec 10% de solution Giemsa pendant 20 minutes, suivi d′un lavage à l′éthanol pendant 1 minute maximum). La surface des cellules peut être mesurée visuellement à l′aide par exemple d′une grille millémétrique (par exemple papier millémétrique transparent) ou d′un oculaire quadrillé. Le mieux est un système de vidéo informatique qui mesure le diamètre.

Remarques :   Après un laps de temps, le silicone va devenir beige. Ce changement de couleur n′altère en aucun cas les propriétés des matières. Mais en cas d′endommagement irréparable du silicone (par exemple, certaines parties du silicone ne collent plus à l′acier ou le silicone n′est plus étanche), il est préférable de renoncer à son utilisation. Veuillez s.v.p. dans ce cas garder les parties défectueuses afin que nous puissions polymériser plus tard de nouvelles parties.

J′espère que vous serez satisfaits de cet essai. N′hésitez pas en cas d′incompréhension ou d′obscurités à me demander des explications, je me tiens à cet effet. Je vous serais bien entendu très reconnaissant de connaître vos propres expériences ou suggestions.

Offre
À des fins de recherche, vous pouvez obtenir un kit essai de migration (un set de 24 fences) chez nous au prix de € 430.oo (EURO) plus frais de transport et éventuellement TVA ou douanes nationales.

  Tel.: +49 241 4500 358